シングルセル解析を活用することで、従来のバルク解析では不可能であった、細胞ごとの詳細なデータ取得が可能となりました。本記事では、シングルセル解析のメリットや原理、解析に用いる機器や活用事例についてご紹介します。
シングルセル解析とは細胞ごとに分析を行う手法
シングルセル解析の概念やメリットを理解するためには、これまで主な手法とされてきたバルク解析との比較が最も理解しやすいでしょう。
バルク解析では、複数の細胞をまとめてすり潰し、調製された試料を用い、全体平均のデータを取得します。これに対してシングルセル解析は、個々の細胞ごとに独立したデータを取得して分析する手法です。同じ種や組織として分類される細胞であっても、タンパク質やメッセンジャーRNA（mRNA）などの発現量はそれぞれの細胞で異なり、その違いが機能発現に重要な役割を果たすことが近年示されつつあります。しかし、バルク解析ではこのような細胞ごとの差異データを取得することができません。
そこで、シングルセル解析を活用すると、mRNAの発現量を細胞ごとに測定できます。また、免疫グロブリンのような個体内での多様性が大きいタンパク質の遺伝子配列についても、細胞間での違いを解析することが可能です。
シングルセル解析のメリットと注目されている背景
従来は、組織を構成する細胞集団の平均データのみ取得することが一般的でした。しかし現在では、技術の進歩に伴い、短時間での微量な物質の分析や、細やかな操作でのサンプル採取が可能となり、個々の細胞に関する情報が取得できるようになりました。その結果、以前の予測より細胞種が多様であることや、同種の細胞であっても個性に富んでいることが解明されつつあります。個々の細胞種の多様性が明らかになったことから、シングルセル解析の重要性が理解され、有用な研究手法として急速に普及しています。
シングルセル解析には細胞ごとのデータを取得できるメリットがあるため、特に、実臨床での活用に向け注目が集まっています。例えばがん治療では、正常細胞と比較してがん細胞は不均一性があり、治療抵抗性に寄与する可能性が考えられています。シングルセル解析を用いてがん細胞ごとの遺伝子を解析することで、特定の細胞のみが持つ治療抵抗性遺伝子を同定し、有効なアプローチを選定する手助けとなるでしょう。また、新型コロナウイルスに関しては、オミクロン株のようなウイルス遺伝子の変異や、ワクチン接種後の免疫反応の変化を研究する手法としても用いられています。さらには人工多能性幹細胞（iPS細胞）の分化誘導技術にも活用されており、今後も実用性が高まると考えられます。
シングルセル解析の原理
シングルセル解析は大きく、細胞単離、測定、データ解析の３つのステップに区分できます。細胞単離（サンプリング）から測定までが一連のプラットフォームになっている装置も存在しますが、ここでは前提となる細胞培養を除き、細胞単離からデータ解析の３つのステップについて解説します。
細胞単離（サンプリング）
シングルセル解析は細胞を培養したのち、培養中の集団の細胞から単一細胞を採取することから始まります。単一細胞の採取にはフローサイトメーターやマイクロ流路、キャピラリーピッキングなど、様々な技術を応用した装置や手法が用いられています。なお、サンプリング装置の中にはその後の測定用のサンプル調製までが一連のプラットフォームになっているものもあります。
測定
採取した単一細胞毎にサンプルを調製し、様々な分析を行います。代表的なシングルセル解析手法の一つが次世代シーケンサー（NGS）を用いたシングルセルRNAシーケンスと呼ばれる遺伝子発現解析です。まず、ひとつの細胞に含まれる全てのmRNAを鋳型とした逆転写反応によって、相補的DNA（cDNA）を作成します。 次に、このcDNAを断片化とタグ付けをしながらポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅します。最後に、増幅した産物を次世代シーケンサ（NGS）にかけることで、cDNAの配列データを取得します。
データ解析
シングルセルRNAシーケンスでは取得した配列データから、各々の遺伝子発現量を網羅的に解析（トランスクリプトーム解析）できます。主成分分析等により次元削減したデータから個々の細胞をクラスタリング（特徴ごとにグループ分け）することができます。同じに見える細胞でもそれぞれ異なる特徴があることが分かります。
シングルセル解析の発展
遺伝子解析からタンパク質や代謝物の解析へ
シングルセル解析では現在、主にmRNAやDNAを対象とした遺伝子解析が行われています。一方で、生命現象に重要な役割を果たすタンパク質のシングルセル解析は遺伝子解析と比べると大きく遅れています。これは、遺伝子解析では分析対象を定量的に増幅することができるため、単一細胞という超微量サンプルからでも安定して測定できる技術が次々と開発されているのに対し、タンパク質は増幅することができないため、検出することが難しいという課題があるためです。しかし、近年は質量分析装置の高感度化や新たなサンプル調製方法の開発により、タンパク質や代謝物の解析など、遺伝子解析以外の解析も発展してきています。
細胞の空間情報を保持した解析へ
従来のシングルセル解析では、培養中の細胞を一旦集団のまま培養容器から剥がして細胞懸濁液の状態にしてからフローサイトメーターやマイクロ流路を応用した技術により単離する手法が主流でした。
しかし技術の進歩により、事前に細胞懸濁液にすることなく、培養状態を維持したまま特定の細胞のみをサンプリング可能な装置も近年発売されています。このような装置では、細胞の空間情報を保持して解析できるようになりました。 加えて、細胞の中の特定の部位やオルガネラが局在する場所のみをピンポイントでサンプリングできる装置であれば、さらに詳細な細胞機能を解析できます。
横河電機のSingle Cellome™ System SS2000は上記のような空間情報を保持した解析を実現可能です。横河電機のSingle Cellome System SS2000の詳細はこちらからご覧下さい。
シングルセル解析の活用事例
ここからは、シングルセル解析における具体的な活用事例を、弊社製品を例にご紹介します。
横河電機で提供しているSingle Cellome System SS2000は、培養中の細胞について位置・形態情報を保持しつつ、RNAや細胞小器官といった多様な細胞内成分を単一細胞から直接サンプリングできるシステムです。多様な種類の細胞に対応しており、継時変化の測定や薬剤処理などの実験も交えつつオルガネラやRNAといった細胞内成分を解析できます。
以下で詳しくご説明しましょう。
オルガネラサンプリングおよび遺伝子解析
Single Cellome System SS2000では、共焦点顕微鏡で高精細な3D画像を撮影しながら、サンプル採取するガラスチップの精密な位置決めや、全自動システムによる簡便な操作を実施できます。この技術を通じて、1細胞単位で細胞内成分のサンプリングが可能となりました。
特定の細胞内成分を選択的に採取し、分析することで未知の細胞機能や疾患メカニズムの解明に貢献します。
1細胞サンプリングおよびシングルセルRNA-seq
分化していく過程の細胞を１細胞毎にサンプリングし、次世代シーケンサにより遺伝子発現の変化を解析しました。 SS2000は個々の細胞の画像情報を記録することにより、細胞の位置情報や形態情報といった空間情報を持ったサンプリングを可能にします。それにより、細胞の形態変化と遺伝子発現の変化を結びつけることが可能です。また、培養状態を維持したまま標的とする細胞のみをサンプリングすることができます。同じ培養容器から異なる時間で繰り返しサンプリングすることが可能なため、分析時の培養容器間のバラつきを抑えることができます。
薬剤処理した細胞内成分のサンプリングおよび質量分析
薬剤処理を施した培養細胞から細胞内成分をサンプリングすることで、薬剤の細胞内局在を調べた事例についてご紹介します。 HepG2細胞をAmiodaroneで処理すると、脂肪滴の凝集が確認されました。単一細胞より凝集した脂肪滴をガラスチップで採取し、得られた試料について質量分析を実施しました。その結果、Amiodaroneに対応するピークが検出され、脂肪滴内にAmiodaroneが蓄積していることが確認できました。 細胞内の特定の部位をサンプリングし質量分析することで、投与した薬剤の細胞内局在や代謝レベルを解析することができます。
様々な細胞におけるサンプリング
Single Cellome System SS2000は、浮遊細胞からのサンプリングや、ヒトiPS細胞の多能性を維持した状態でのサンプリングといった、種々の細胞種を対象とした細胞内成分の採取が可能です。サイズが20μm以上あるHeLa細胞のように、さまざまな大きさの細胞でも丸ごとサンプリングできることを確認しています。また、目的とするオルガネラを選択的に採取することや、細胞体や軸索といった特定の部位に絞ってサンプリングすることもできます。顕微鏡で観察しながら特異的な挙動を示す細胞のみをシングルセルクローニングすることや、同じ培養容器から継時的にサンプリングすることなど、複雑な実験手技にも対応したシステムです。
関連記事
https://www.yokogawa.co.jp/library/resources/application-notes/sampling-examples-in-various-cells/
新規細胞内デリバリー技術との連携による１細胞解析ソリューション
Single Cellome Unit SU10は、先端外径が最小数十nmのナノピペットにより、目的の物質を直接細胞や核内 にデリバリーする革新的な装置です。SU10で特定の細胞に外来遺伝子を導入し、細胞が変化する様子をSS2000で観察しました。さらに、SS2000で変化が起きた細胞のみを選択的にサンプリングすることができます。 １細胞レベルでの細胞の操作、観察、採取といった一連のソリューションを提供します。
シングルセル解析に新たな付加価値を与える横河電機のSingle Cellome
シングルセル解析は、個々の細胞種の多様性が明らかになった現在、一つ一つの細胞を分析できる非常に重要な解析手法です。様々な研究で活用されていますが、横河電機のSingle Cellome System SS2000を活用することで、空間情報を持ったシングルセル解析や特定の細胞内成分を１細胞レベルで分析できます。製品の詳細についてはこちらのページよりご覧下さい。本システムを利用するにあたってご不明な点や疑問などございましたら、ぜひお気軽にお問合せください。
関連製品＆ソリューション
-
細胞内サンプリングシステム SS2000
SS2000は共焦点顕微鏡で培養中の細胞を撮像しながら、1細胞レベルで細胞内の特定の部位や領域を全自動で直接サンプリングするシステムです。細胞を丸ごとサンプリングすることも可能です。培養中の細胞を剥がす必要がないため、位置情報や形態情報が保持されます。
-
自動ナノデリバリー/自動ナノサンプリング SU10
ナノピペットを使用した細胞への穿刺、デリバリー、抜去等の一連の動作を自動化する顕微鏡コンポーネントシステムです。ナノピペットの先端サイズが非常に小さいことから細胞へのダメージを最小限にし、ライブセルを対象とした細胞の操作と解析が可能になります。